5 компонентов ПЦР играют решающую роль в амплификации ДНК.
Обязательными элементами реакционной смеси для полимеразной цепной реакции являются:
- ДНК шаблон;
- два ПЦР праймера;
- ДНК полимераза;
- дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP);
- буферный раствор.
ДНК матрица для ПЦР амплификации
Множество различных биологических объектов могут служить источником ДНК для 3 основных стадий полимеразной цепной реакции.
ПЦР является высокочувствительным методом и для успешной амплификации требуется присутствсие только одной или двух молекул ДНК. Тем не менее, оптимальное количество ДНК для ПЦР амплификации зависит от состава ДНК и используемой ДНК-полимеразы.
Важно оптимизировать количество используемой ДНК, потому что высокие количества приводят к неспецифической амплификации, тогда как низкие количества уменьшают производительность полимеразной цепной реакции.
Обычно 0,1-1 нг плазмидной ДНК или 5-50 нг геномной ДНК достаточно для ПЦР реакционной смеси объемом 50 мкл.
Функция дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP) в ПЦР
Дезоксинуклеозидтрифосфаты служат строительными блоками из которых ДНК полимераза синтезирует новую цепь ДНК во время последовательных циклов амплификации. Четыре основных нуклеотида ПЦР реакционной смеси - dATP, dCTP, dGTP и dTTP.
Для оптимального включения оснований в синтезируемую цепь ДНК их обычно добавляют к реакционной смеси ПЦР в эквимолярных количествах.
Как правило, конечная концентрация каждого дезоксинуклеозидтрифосфата составляет 0,2 мМ.
Состав ПЦР буфера
Буфер реакционной смеси ПЦР служит химической средой для поддержания активности и стабильности ДНК полимеразы. РН буфера обычно колеблется от 8,0 до 9,5 и часто стабилизируется Трис-HCl.
Одним из компонентов буфера Taq-полимеразы является ион калия (KCl), который способствует отжигу праймеров.
Буферная концентрация ионов магния является еще одним важным фактором для правильного функционирования ДНК-полимеразы. Ионы магния служат кофактором для ДНК полимеразы.
Кроме этого, ионы магния облегчают образование комплекса между праймерами и матрицами ДНК стабилизируя отрицательные заряды фосфатных групп в скелете ДНК.
Как правило, концентрация магния составляет 1,5 мМ.
Более высокая концентрация магния связана с более высоким выходом конечного продукта, но более низкой специфичностью полимеразы, тогда как меньшая концентрация магния связана с пониженной активностью и повышенной специфичностью фермента.
Роль праймеров ПЦР
Для ПЦР требуются знание последовательности ДНК, которые ограничивают синтезируемый фрагмент.
Праймеры представляют собой короткие нуклеотидные последовательности (синтетические олигонуклеотиды около 15-30 оснований длиной), которые спариваются с реплицируемой ДНК матрицей.
Для того чтобы происходила гибридизация нуклеотидов праймеров с ДНК матрицей, праймеры должны иметь последовательность, которая комплементарна 3'-концу каждой цепи последовательности ДНК мишени, а также 3'-концы гибридизованных праймеров должны указывать друг на друга.
Для полимеразной цепной реакции последовательности праймеров очень важны, потому что реакционный цикл имеет определенные величины температур, используемые на этапах нагрева и охлаждения.
Кроме того, большой избыток праймеров в реакционной смеси ПЦР приводит к тому, что они с большей вероятностью сталкиваются с частично комплементарным праймером, чем с полностью комплементарной ДНК матрицой. Таким образом, следует избегать комплементарности праймеров друг другу.
Два олигонуклеотидных праймера должны быть смоделированны и химически синтезированы.
Возрастающее количество биоинформатических ресурсов помогает при разработке праймеров и делает дизайн и выбор условий реакции намного более простыми. Эти ресурсы позволяют вводить ДНК последовательности, подлежащие амплификации, выбирать длину праймера и другие детали дизайна. После анализа эти программы предоставляют набор подходящих последовательностей праймеров.
Используя подходящие последовательности, ДНК праймеры могут быть синтезированы в течение нескольких дней.
Функция Taq ДНК-полимеразы в ПЦР
Taq ДНК-полимераза является наиболее часто используемым ферментом для стандартной ПЦР.
Taq ДНК-полимераза представляет собой фермент, который реплицирует ДНК. ДНК-полимеразы распознают праймеры как участки с которых начинается синтез.
Одним из недостатков ПЦР-реакций была температура, необходимая для денатурации ДНК, поскольку она также денатурирует ДНК-полимеразу. В настоящее время в полимеразной цепной реакции используется специальная форма ДНК-полимеразы - термостабильная ДНК-полимераза.
Появление термостабильной ДНК-полимеразы обеспечило условия для автоматизации реакции. Первоначально термостабильная Taq ДНК полимераза была выделена из Thermophilus aquaticus - бактерии которые обитают в горячих источниках.
Taq ДНК полимераза имеет оптимальную температуру репликации - 75–80oC и выдерживает длительное воздействие температур до 96oC. Таким образом, она может оставаться активной после каждого из шагов денатурации.
Благодаря способности автоматизировать реакцию ПЦР были созданы термоциклеры, дающие возможность устанавливать температуру и время для каждой реакции ПЦР.
Помимо этого термостабильного свойства, Taq-полимераза является обыкновенной ДНК-полимеразой. Она синтезирует новую цепочку ДНК, комплементарную одноцепочечной ДНК матрице, и, как и другие ДНК-полимеразы, для ее синтеза требует наличия праймера.
У Taq полимеразы отсутствует коррекционная активность и она неспособна исправлять неправильные встроенные нуклеотидные основания. В среднем эти ошибки происходят примерно один раз на каждые 9000 нуклеотидов.
Это свойство может быть важно в некоторых применениях ПЦР, например при клонировании, потому что продукт ПЦР может быть не совсем точной копией исходной последовательности.
Еще одним недостатком Taq полимеразы является то, что она может эффективно амплифицировать только фрагменты в несколько тысяч пар оснований.
Фрагмент ДНК, подлежащий амплификации, не должен превышать ~ 3 kb. Обычно он имеет длинну менее 1 kb.
Амплификация очень длинных фрагментов (до 40 kb) требует специальных методов.
Эти проблемы могут быть решены с использованием других термостабильных полимераз, таких как ДНК-полимеразы Pfu и Pwo. Эти ферменты обладают коррекционной активностью.
Для повышения эффективности ПЦР были разработаны новые поколения ДНК-полимераз. Так как они производят продукты ПЦР более низкой частотой ошибок, то они эффективны для клонирования, амплификации длинных участков и участков, содержащих большое количество GC оснований.
Дополнительные компоненты реакции ПЦР
Для улучшения результатов ПЦР существуют различные ПЦР добавки. Эти компоненты полимеразной цепной реакции могут понижать температуру денатурации матрицы или способствуют стабилизации ДНК-полимеразы.
Обычно используемые ПЦР-добавки включают диметилсульфоксид (ДМСО), сульфат аммония, полиэтиленгликоль, бычий сывороточный альбумин (BSA), желатин, N, N, N-триметилглицин и глицерин.
Ссылки:
Lorenz TC. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments : JoVE. 2012;(63):3998. doi:10.3791/3998.
