Два метода амплификации ДНК:

  1. Клонирование ДНК
  2. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Клонирование ДНК с использованием бактериальных векторов

Клонирование позволяет создавать множественные копии генов и изучать их экспрессию.

Для того, чтобы доставить фрагмент ДНК в бактериальную клетку в той форме, которая будет копироваться или экспрессироваться, этот фрагмент сначала вводится в плазмиду.

Плазмида (также называемая в данном случае вектором) представляет собой небольшую кольцевую молекулу ДНК, которая реплицируется независимо от хромосомной ДНК бактерий. Плазмидные молекулы могут быть использованы для создания «носителя», в который встраивается нужный фрагмент ДНК.

Модифицированные плазмиды обычно вводятся в бактерию – хозяина для репликации. По мере деления бактерий они копируют как свою собственную ДНК, так и ДНК плазмиды.

Клонирование ДНК с использованием бактериальных векторов

Плазмидные векторы содержат множество коротких последовательностей ДНК которые возможно разрезать различными рестрикционными ферментами.

Рестрикционные ферменты (также называемые рестрикционными эндонуклеазами) распознают специфические последовательности ДНК и разрезают их в определенных местах.

Они вырабатываются бактериями как защитный механизм против чужеродной ДНК.

Многие рестрикционные ферменты образуют разрезы в двух нитях ДНК, так что концы разреза имеют одноцепочечный выступ в 2-4 нуклеотида.

Последовательности, которые распознаются рестрикционными ферментами, представляют собой четырех- или восьминуклеотидные последовательности, которые представляют собой палиндромы.

Неспаренные нуклеотиды, остающиеся на концах одной нити рестрицированного фрагмента, часто называемые липкими концами, могут затем образовывать пары оснований (спариваться) с липкими концами, имеющими комплементарную последовательность, другой цепи.

Процесс образования водородных связей между комплементарными последовательностями на одиночных цепях с образованием двухцепочечной ДНК называется отжигом.

ДНК-лигаза (DNA ligase) затем может ковалентно сшить цепи образуя новую молекулу ДНК.

Таким образом исследователи могут получать рекомбинантную ДНК, объединяя ДНК из двух разных источников.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод, используемый для быстрого увеличения количества копий специфических областей ДНК необходимых для дальнейшего анализа.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)

В ПЦР используется специальная ДНК-полимераза – фермент, который реплицирует ДНК, и короткие нуклеотидные последовательности, называемые праймерами (DNA primer), которые спариваются с определенной последовательностью ДНК которая затем реплицируется.

Праймерные нуклеотиды имеют последовательность, которая комплементарна 3'-концу каждой цепи молекулы ДНК по обе стороны от последовательности ДНК необходимой для анализа.

Этапы метода полимеразной цепной реакции (ПЦР)

ПЦР используется в лабораториях для многих целей ДНК анализа. К ним относятся:

  1. идентификация владельца образца ДНК, оставленного на месте преступления;
  2. анализ отцовства;
  3. сравнение небольших количеств древней ДНК с современными организмами;
  4. определение последовательности нуклеотидов в конкретной области.

Статьи в категории "Методы молекулярной генетики":