Полимеразная цепная реакция была впервые разработана в 1983 году Кари Муллисом. На сегодняшний день существует много разных видов ПЦР.

Некоторыми из них являются – RT-PCR (ПЦР с обратной транскрипцией), touchdown PCR, real time PCR (ПЦР в реальном времени), nested PCR («вложенная» ПЦР), Strand Displacement Amplification (амплификаци со смещением нити), Rolling Circle Amplification (амплификация катящегося кольца), Ligase Chain Reaction, Helicase Dependent DNA amplification и т.д.

Двумя группами различных видов полимеразной цепной реакции являются термоциклические методы ПЦР и методы изотермической амплификации.

Различные виды ПЦР-методов, основанных на термоциклировании (стадии нагревания и охлаждения)

Методы термоциклирования используют циклическое чередование температуры для повторения ДНК синтеза.

Множественная ПЦР (Multiplex PCR)

Мультиплексная ПЦР представляет собой метод ПЦР, который позволяет одновременно амплифицировать множество последовательностей мишеней в одной и той же реакционной смеси.

Так как одна реакционная смесь включает в себя наборы пар праймеров для разных ДНК целей, то это уменьшает потребление реагентов ПЦР и в то же время налагает определенные ограничения на используемые праймеры.

Для одновременной работы в одной реакционной смеси наборы праймеров должны быть оптимизированы.

Они должны иметь одинаковые температуры отжига и производить продукты амплификации (ампликоны) разного размера с образованием четко различимых гель-электрофорезных полос для последующего ПЦР-анализа.

Мультиплексная ПЦР

«Гнездовая» или вложенная ПЦР (Nested PCR)

Вложенная ПЦР используется для увеличения специфичности амплификации ДНК путем уменьшения числа побочных продуктов реакции.

В этом методе используются два набора праймеров.

Первый набор обеспечивает первую полимеразную цепную реакцию. Продукт этой реакции служит источником ДНК-мишени для второй ПЦР с использованием второго набора праймеров.

Гнездовая ПЦР

Лигазная цепная реакция (Ligase Chain Reaction, LCR)

Праймеры лигазной цепной реакции намного длиннее, чем обычные праймеры для ПЦР, и предназначены для покрытия всей последовательности, подлежащей амплификации.

На первой стадии отжига праймеры сшивают термостабильной ДНК-лигазой.

Праймеры лигазной цепной реакции

Это генерирует фрагмент, который состоит из пары праймеров и служит в качестве шаблона для последующих циклов.

Лигазная цепная реакция

Основным преимуществом лигазной цепной реакции является то, что одноточечная мутация в исходной матричной ДНК может предотвратить реакцию и отсутствие продукта может быть индикатором мутаций.

Количественная ПЦР (Quantitative PCR, qPCR)

Количество продукта, которое синтезируется в течение заданного количества циклов ПЦР, зависит от количества молекул ДНК, которые присутствуют в исходной смеси. Это позволяет использовать ПЦР для количественного определения количества молекул ДНК, присутствующих в экстракте.

В количественной ПЦР количество продукта, синтезированного во время тестовой ПЦР, сравнивают с количествами, синтезированными во время ПЦР, с известными количествами исходной ДНК.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени (real-time PCR)

Сегодня квантификация ПЦР проводится в реальном времени - модификация стандартного метода ПЦР, в котором синтез продукта измеряется с течением времени.

ПЦР с обратной транскрипцией

Чаще всего этот метод используется для измерения количества РНК. Например, чтобы определить экспрессию конкретного гена в раковых клетках. Этот метод позволяет контролировать развитие рака.

ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR)

Для проведения ПЦР, где РНК является исходным материалом, этот метод ПЦР использует обратную транскриптазу, процесс, называемый ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR).

Первым шагом в этом методе является превращение молекул РНК в одноцепочечную комплементарную ДНК (кДНК). После этого этапа эксперимент протекает так же, как в стандартной методике.

Некоторые термостабильные полимеразы, такие как Tth, обладают обратной транскриптазной активностью в определенных буферных условиях и способны копировать как РНК, так и ДНК молекулы.

Различные виды ПЦР-методов, основанных на изотермической амплификации ДНК

Изотермические методы не зависят от термоциклирования. С ними легче работать и они требуют меньше энергии, чем стандартные методы ПЦР.

Изотермические методы используют ДНК-полимеразы с активностью cмещения нитей.

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)

ПЦР-реакционная смесь для Loop-mediated isothermal amplification имеет ДНК-полимеразу с активностью cмещения нитей вместо Taq-полимеразы. Для проведения реакции смесь выдерживают при постоянной температуре (около 65°С).

Репликация по типу катящегося кольца (Rolling Circle Amplification, RCA)

При репликации по типу катящегося кольца сначала два конца ДНК мишени объединяются вместе с использованием ДНК-лигазы для образования круглого одноцепочечного шаблона. Праймер прикрепляют к этому ДНК шаблону во время отжига. Амплификация выполняется до завершения синтеза круга. Синтезированная цепь смещается из-за свойства полимеразы с активностью cмещения нитей.

Основное преимущество заключается в том, что синтез может происходить при комнатной температуре.

Хеликаз зависимая ДНК амплификация (Helicase-Dependent DNA Amplification, HDA)

Хеликаз зависимая ДНК амплификация зависит от активности ДНК-хеликазы для разделения двухцепочечной ДНК.

Основное преимущество заключается в том, что хеликаза может работать при комнатной температуре.

data-matched-content-ui-type="image_card_stacked"